繁多的顯微鏡種類你又解多少呢？

暗視野顯微鏡不具備觀察物體內部的細微結構的功能，但可以分辨 0.004μm 以上的微粒的存在和運動。因而常用于觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。暗視野顯微鏡的基本原理是丁達爾效應。當一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現的一條光亮的灰塵"通路"，這種現象即丁達爾效應。暗視野顯微鏡在普通的光學顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內部拋物面結構的遮擋，照射在待檢物體表面的光線不能直接進入物鏡和目鏡，僅散射光能通過，因而視野是黑暗的。操作者通過目鏡觀察到的，是檢物體的衍射光圖像。

暗視野顯微鏡的基本使用方法如下：

1．安裝暗視野聚光器（或用厚實的黑紙片制成遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方，也能得到暗視野效果）。

2．選用強光源，一般用顯微鏡燈照明，以防止直射光線進入物鏡。

3．在聚光器和玻片之間加一滴香柏油，避免照明光線于聚光鏡上進行全反射，達不到被檢物體，而得不到暗視野照明。

4．進行中心調節，即水平移動聚光器，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。升降聚光器，將聚光鏡的焦點（圖 2 中圓錐光束的頂點）對準待檢物。

5．選用與聚光器相應的物鏡，調節焦距，按普通顯微鏡的方法操作。

 

體視顯微鏡又稱實體顯微鏡或解剖鏡，其成像為正立三維的空間影像，并具有立體感強、成像清晰寬闊、長工作距離（通常為 110 mm）以及連續放大觀看等特點。生物學上常用于解剖過程中的實時觀察。

普通光學顯微鏡的光源為平行光，因而形成的是二維平面影像；而體視顯微鏡采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角體視角（一般為 12o15o），因而能形成三維空間的立體圖像。體視顯微鏡與普通光學顯微鏡的使用方法相近，但更為便捷。二者的主要區別在于：

1. 體視顯微鏡的鏡檢對象可不必制作成裝片。

2. 體視顯微鏡載物臺直接固定在鏡座上，并配有黑白雙面板或玻璃板，操作者可根據鏡檢的對象和要求加以選擇。

3. 體視顯微鏡的成像是正立的，便于解剖操作。

4. 體視顯微鏡的物鏡僅一只，其放大倍數可通過旋轉調節螺旋連續調節。

 

熒光顯微鏡是利用細胞內物質發射的熒光強度對其進行定性和定量研究的一種光學工具。細胞內的熒光物質物質有兩類，一類直接經紫外線照射后即可發熒光，如葉綠素等；另有一些物質本身不具這一性質，但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色，經紫外線照射后亦可發熒光（附圖 1-4）。

熒光顯微鏡的原理為利用一個高發光效率的點光源（如超高壓汞燈），經 過濾色系統發出一定波長的光(如紫外光3650λ 或紫藍光4200λ)作為激發光，激發標本內的熒光物質發射出各色的熒光后，再通過物鏡后面的阻斷(或壓制)濾光片的過濾，最后經由目鏡的放大作用加以觀察。阻斷濾光片的作用有二：一是吸收和阻擋激發光進入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特定的熒光透過，表現出專一的熒光色彩。

熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種：

1．透射式熒光顯微鏡 較為舊式的熒光顯微鏡，其激發光源通過聚光鏡穿過標本材料來激發熒光。其優點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱。所以它僅適用于觀察較大的標本材料。

2．落射式熒光顯微鏡 激發光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡

光路中需加上一個雙色束分離器（分色鏡），它與光軸呈 45o 角，激發光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發光同時進入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發光和熒光分開，殘余激發光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。

 

相差顯微鏡是能將光通過物體時產生的相位差（或光程差）轉變為振幅（光強度）變化的顯微鏡。主要用于觀察活細胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標本。人眼只能鑒別可見光的波長（顏色）和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數生物標本高度透明，光波通過后振幅基本不變，僅存在相位的變化。相差顯微鏡基本把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了 1/4λ（波長），如果再增加或減少 1/4λ，則光程差變為 1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差

從結構上看，相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處在于：

1．環形光闌具有環形開孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。

2．相位板相差顯微鏡在物鏡內部增加了涂有氟化鎂的相位板，作用是將直射光或衍射光的相位推遲 1/4λ。相板上有兩個區域，直射光通過的部分叫"共軛面"，衍射光通過的部分叫"補償面"。相位板按工作效果分為兩種類型：

（1）A+相板：將直射光推遲 1/4λ，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加明亮，形成亮反差（或稱負反差）。

（2）B+相板：將衍射光推遲 1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標本結構比周圍介質更加暗淡，形成暗反差（或稱正反差）。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上標以"Ph"字樣。

3．合軸調節望遠鏡

相差顯微鏡配備有一個合軸調節望遠鏡（在外殼上標有"CT"符號），用于調節環狀光闌的像與相板共軛面完全吻合，以便實現對直射光和衍射光的特殊處理。使用時撥去一側目鏡，插入合軸調節望遠鏡，調節合軸調節望遠鏡的焦點，視野中會呈現兩個圓環，分別是明亮的環狀光闌圓環與較暗的相板上共軛面圓環。再轉動聚光器上的環狀光闌的兩個調節螺旋，使兩環完全重疊。如明亮的光環過小或過大，可調節聚光器的升降旋鈕，使兩環完全吻合。如果聚光器已升到最高點或降到最低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應更換。調好后即可取下合軸調節望遠鏡，換回目鏡。

4．綠色濾光片

用于調整光源的波長。照明光線的波長不同，會引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調整。相差顯微鏡的使用步驟如下：

① 根據待檢標本的性質及要求，挑選適合的相差物鏡。

② 將標本玻片放到載物臺上，進行光軸中心的調整。

③ 使用合軸調節望遠鏡，調 整環狀光闌與相板上的共軛面圓環完全重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過程中，每次更換物鏡倍數時，必須重新進行環狀光闌與相板共軛面圓環吻合的調整。

④ 加綠色濾光片，按普通光學顯微鏡的操作步驟進行觀察。

 

倒置顯微鏡的結構和普通顯微鏡基本相同，只不過物鏡與照明系統位置交換，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上。主要用于觀察培養的活細胞，需配制相差物鏡。

 

偏光顯微鏡可用于檢測具有雙折射性的物質，如染色體、膠原、纖維絲等。

和普通顯微鏡不同的是：

① 偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光。

② 鏡筒中有檢偏振鏡（檢偏器，一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器）。

③ 使用旋轉載物臺。當載物臺上放入單折射的物質時，無論如何旋轉載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質時，由于光線通過這類物質時發生偏轉，因此旋轉載物臺便能檢測到這種物體。

④ 配備補償器或相位片；

⑤ 使用專用無應力物鏡。

 

 

透射電子顯微鏡的組件包括：

1. 電子槍 發射電子，由陰極、柵極、陽極組成。

2. 聚光透鏡 即電子透鏡，將電子束聚集，可用于控制照明強度和孔徑角。

3. 樣品室 放置待觀察的樣品，并裝有旋轉臺，用以改變試樣的角度，還有裝配加熱、冷卻等設備。

4. 物鏡 為放大率很高的短距透鏡，作用是放大電子像。物鏡是決定透射電子顯微鏡分辨能力和成像質量的關鍵。

5. 中間鏡 為可變倍的弱透鏡，作用是對電子像進行二次放大。通過調節中間鏡的電流，可選擇物體的像或電子衍射圖來進行放大。

6. 透射鏡 為高倍的強透鏡，用將二次放大后的中間像進一步放大后在熒光屏上成像。

7. 二級真空泵 對樣品室抽真空。

8．照相裝置 用以記錄影像。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會影響到最后的成像質量，必須制備更薄的超薄切片，通常為 50～100 nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時的樣品需要處理得很薄。通常用薄切片法或冷凍蝕刻法制備：

（1）薄切片法 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度 20～50 nm，采用重金屬鹽染色，以增大反差。

（2）冷凍蝕刻法 亦稱冰凍斷裂法。將標本置于100？C 的干冰或196？C 的液氮中冰凍后，以冷刀急速斷開標本。斷裂的標本升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結構，稱為蝕刻。蝕刻完成后，向斷面以 45o 角噴涂一層蒸氣鉑，再以90o 角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，剝下碳和鉑的膜，稱為復膜，能顯示標本蝕刻面的形態。在電鏡下觀察得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。

 

掃描電子顯微鏡于 20 世紀 60 年代問世，目前分辨力可達 6～10 nm。其工作原理是由電子槍發射的精細聚焦電子束經兩級聚光鏡、偏轉線圈和物鏡射到樣品上，掃描樣品表面并激發出次級電子，次級電子的產生量與電子束入射角有關，即與樣品的表面結構有關。次級電子經探測體收集后，由閃爍器轉換為光信號，再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。掃描電鏡的標本在檢驗前，需進行固定、脫水處理，再噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。

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